Tuesday, October 31, 2006
molecular cloning 如何製作勝任細胞?
在我們和生技公司購買大腸桿菌勝任細胞時，它通常是以零下-80度C的包裝運送；為了保持這勝任細胞的活性，我們也應將原廠的原始菌種（stock）固定存放在-80度C的冷凍庫中。為了節省經費，這裡介紹一種簡單的製作方法，實驗者可以自行在實驗室裡根據以下步驟進行勝任細胞的製作。
製作方法
（一）首先，我們準備培養大腸桿菌的培養液LB broth（配方見下表一）、保存勝任細胞的TSB緩衝液（配方見下表二）、預約好光譜儀（spectro-photometer）和低溫離心機（ centrifugator）。以LB培養液而言，我們加入秤好的三種原料之後，將整瓶培養液放到滅菌機中進行滅菌（autoclave）。無菌取放3 ml的培養液在養菌專用的試管（Falcon：15 ml），用乾淨的牙籤沾一點原始菌種加入試管，將試管放進37度C、240 rpm震盪的細菌培養箱培養16小時。
（二）再準備50 ml LB培養液，倒入滅好菌的錐形瓶。將培養16小時的菌液取100 ul的量（比例約1：500）加入，再放進細菌培養箱培養約3小時。預約光譜儀設定可見光波長為595 nm進行比色，使用乾淨的LB培養液1 ml放入比色管先矯正讀值零點，再將培養3小時的菌液進行比色，確定OD讀值落在0.45～0.55 之間（這讀值代表細菌的生長週期落在其log phase），確定細菌的生長週期之後，之後的操作均在冰上進行。
（三）將菌液進行離心（Beckman Rotor），離心的條件為4度C、3000 rpm歷時10分鐘，倒掉上方澄清的培養廢液，再用力敲打離心管使下方沈積的細菌塊鬆散，加入5 ml（置備50支勝任細胞的量）TSB緩衝液（含5% DMSO）。
（四）準備冷劑，主要是利用敲碎的乾冰，加入95%的酒精，將試管架的底部浸入約2 cm。在無菌台中操作（laminar flow）、快速地分裝100 ul的菌液到50支乾淨的試管（eppendorf）中，放入冷劑內迅速結凍，之後這些勝任細胞放在-80度C保存。
效能檢定與心得討論
大腸桿菌勝任細胞的使用效能主要可以分為下列兩點討論：
（ㄧ）細胞吃入質體的大小：早期所使用的勝任細胞品係，如 DH5-alpha、XL1-Blue等....大多可以應付10 kb以下大小的質體。但是，隨著基因工程的快速進展，實驗者遇到10 kb 以上的構築實驗機會並不小，所以各家廠商無不專研於研發可以“吃進“更大質體的勝任細胞品係。舉例來說，現在市面上所販售的勝任細胞（如台灣自製的品牌 ECOS 101）大都可以進行10～40 kb的質體操作，這裡必須注意一點，通常質體越大的構築實驗，塞選到正確菌落（colony）的成功機會越小，所以千萬別小看這些市面上販售的「高級」勝任細胞品係，它們真的可以幫你省下很多寶貴的時間。
（二）轉型效率（transformation efficiency）：轉型效率是影響質體構築實驗成功與否的重要關鍵。用公式來表示轉型效率=所得菌落數目（colony number）/所用的質體DNA質量（ug），換句話說，給予相同質量的質體DNA，一支轉型效率較好的勝任細胞會長出較多的菌落數目，實驗者自製的每一批勝任細胞在使用前都應該
進行 轉型效率的測試方可安心使用。這裡介紹一個計算轉型效率的小幫手http://www.sciencegateway.org/tools/transform.htm。一支好的勝任細胞其轉型效率應介於 107 ～ 1010之間（以熱浴方式、質體 pUC-19進行測試）。
附帶一提，影響轉型效率的因素還有很多，如質體DNA的品質、質體轉型所採用的方式（heat shock、 chemical or electroporation）、轉型後的培養時間、使用的培養基（LB or SOC medium）、使用質體DNA的大小等.....以台製販售的 ECOS 101而言，採用 42 oC、3.秒熱浴的方式，給予2.7 kb的質體 DNA轉型效率約1.6 ～ 5.5 x 109/ ug，而10.0 kb的質體 DNA轉型效率約4.0 ～ 9.0 x 106/ ug。（引用自官方網站 http://www.yeastern.com）。
工欲善其事，必先利其器。製作好用的勝任細胞是成功進行「克隆」實驗的第一步，這裡介紹方法足以應付一般實驗室的需求，實驗者可以自行在實驗室進行製作。如果實驗者發現很多次的嘗試都無法挑到你想要接成的架構質體，可依下列程序思考問題解決：
（一）切出DNA接點的限制酵素選取是否有錯？是否考慮別的限制酵素在試一次？
（二）DNA的純度夠不夠？一般建議進行接合的材料都要經過 Column或 phenol /chloroform的純化？
（三）是否選用正確的抗生素進行菌落篩選？如雜菌很多建議配置全新的抗生素與培養基使用。
（四）根據你的實驗目的隨時調整你所選用的勝任細胞品係，舉例來說，進行cDNA library的選植實驗就不建議用自製的勝任細胞，如果實驗者欲研究的基因其cDNA表現量就已經不高，他可能會浪費很多的時間還達不到目的。
「克隆」實驗、或是基因工程之所以迷人就是因為「條條道路通羅馬」！這是筆者自身的經驗，幾次嘗試不成之後，表示其中一定有實驗者疏忽或弄錯的地方，這時建議將實驗參數一樣樣進行有「系統」地調整，天無絕人之路，成功常常再不經意的改變之後獲得！
