實驗室手扎

接下來因應實驗者對質體DNA在數量和純度上的需求，介紹一種稱為”Banding”的質體DNA的抽取方法。所謂的banding是將質體DNA透過高密度介質氯化銫（CsCl）在超高速離心（ultracentrifuge）下形成分離，質體DNA在超高速離心的氯化銫中形成單一個帶狀故名。因為培養細菌的種類和時程會影響最後質體DNA的產量，故以下以一般實驗室常用的菌種XL1-Blue，吃入質體DNA含Amp選質基因為例，根據實驗時間來依序介紹。

（一）第一天下午五點將單珠菌種移植到3 ml的LB培養液（A+T：使用前加入tetracycline：12.5 ug/ml與ampicilin：50 ug/ml），準備或預借之後所需的實驗材料如下：




滅好菌的LB培養液（500 ml/construct）
測OD值所需比色管
Beckman GSA 10 rotor離心用的250 ml離心管（ 兩支 /construct ：檢查每支管子的O-ring是否完好）
Chloramphenicol（34 mg/ml：in pure ethanol；2.5 ml/construct）
Solution 1（30 ml /construct）
Solution 2（60 ml /construct）
Solution 3（45 ml /construct）
乾淨的紗布數塊
Isopropanolol（0.6倍體積約81 ml /construct）
1xTE（溶解DNA用，pH=8.0、20 ml /construct）
7.5M Ammonium acetate（4 ml /construct）
Beckman SS-34 rotor與其50 ml離心管（兩支 /construct）
100%酒精（30 ml /construct）
RNase A（10 ul /construct）
CsCl（10 g /construct）
Beckman ultracentrifuge用rotor NVT-65、蓋子（cap）、cap封口把手（有磅數指針）、原廠離心管及封口 焊鐵（見附錄一）
1 ml、5 ml注射針數支、18號、21號針頭、一般15 ml離心管
EtBr（1 ml /construct）
手提式紫外光燈
l-butanol（pure & saturated：含水）
透析用DNA袋子、夾子和裝4公升TE溶液的容器，stir bar等....

（二）第二天上午11點將3 ml的菌液取1 ml加到500 ml的 LB培養液（A+T），再放回培養箱進行培養。9～10小時之後進行菌液OD值比色，以乾淨的LB（ A+T）為基準做校正，確定細菌生長週期達到plateau（OD值約0.8～1.0之間）。此時加入2.5 ml的 Chloramphenicol（final concentration=170 ug/ml）， 再放回培養箱養16小時 。Chloramphenicol的作用在於使細菌停止細胞複製，儘量製造更多的質體DNA，。

（三）第三天下午2點回收細菌，將菌液分裝到250 ml的離心管內，進行4500 rpm（Beckman GSA 10 rotor）、4度C離心20分鐘。倒掉上清液留下下方的pellet，敲打試管或vortex使pellet完全散開，再依序加入S1 30 ml，invert數次，靜置室溫15分鐘；S2 60 ml， gently invert數次，靜置冰上15分鐘；S3 45 ml， gently invert數次， 靜置冰上15分鐘。之後進行5000 rpm（GSA 10 rotor）、4度C離心20分鐘。

（四） 以雙層紗布過濾上清液到另一個乾淨的250 ml離心管，如過濾不乾淨可考慮重覆離心、紗布過濾兩次，確定過濾後的液體澄清，沒有白色沈積物。再加入0.6倍體積的 Isopropanolol（約81 ml）， invert數次，靜置冰上15分鐘。之後4度C離心5000 rpm（GSA 10 rotor）20分鐘，倒掉上清液，這時可見瓶底有透明pellet，倒扣瓶子Dry乾液體數分鐘，加入10 ml TE搖晃均勻，最後將10 ml液體（增加回收率可以分4、3、3 ml三次）放到新的50 ml離心管（for SS-34 rotor）。

（五） 加入4 ml 的7.5M Ammonium acetate， 搖晃均勻後靜置冰上10分鐘，4度C離心4500 rpm（SS-34 rotor）10分鐘，此時下方pellet為殘留的細菌染色體與蛋白質，取上清液到新的50 ml離心管（for SS-34 rotor），加入30 ml 100％的酒精，放置負20度C冰箱至少兩小時；再離心 4度C離心10000 rpm（SS-34 rotor）40分鐘；到掉上清液，真空45度C dry乾1小時（可使用保鮮膜封口再行戳洞），之後加蓋保存負20度C冰箱。

（六）解凍後加入10 ml TE溶解下方pellet（增加回收率可以分4、3、3 ml三次），將溶好DNA的TE移到新的15 ml離心管（先取出5 ul當控制組），加入10 ul的RNase A，37度C作用1小時，取5 ul run gel（這步驟可以檢視RNase A是否將RNA清除乾淨）。

（七）精秤CsCl 10克（誤差再0.001g之內）放入50 ml的離心管，將10 ml的TE加入，搖晃至粉末全部溶解；再用5 ml針筒將液體全部加入 Beckman ultracentrifuge 專用離心管（ NVT-65 rotor專用），加入時液體由管壁緩慢留下，眼睛檢視絕對不可以有氣泡產生。之後用1 ml針筒將EtBr（有毒物質請小心操作！）加入約0.7~1.0 ml，因為上超高速離心一定要兩邊試管重量相等，所以後果不堪設想！所以加入EtBr的質量提供平衡兩試管重量的好機會（平衡的兩試管誤差應小於0.01克），方可上超高速離心機。

（八）小心用Beckman原廠焊鐵封口（見左圖），封口後可以用手用力壓壓看測試是否完整。封口後invert數下，使EtBr混合均勻，包覆錫泊紙以阻絕光線。上機前在確定兩試管重量相等，方可進行超高速離心。 NVT-65 的 rotor 每支離心管都要加 Cap（with O-ring），用原廠把手鎖緊，確定扭力磅秤讀數約120磅，上機進行超高速離心，離心參數為 20度C、65000 rpm 6小時。

（九）解開 Cap，小心翼翼（勿晃動）將離心管用夾子抽出，鋪好bench紙，打開紫外光燈，此時可見三條主要亮帶（見下圖）先用21號針頭由離心管上方插入（release pressure），在用18號針頭、5 ml針筒由質體DNA的band下方刺入離心管，抽出橘紅色液體約1～2 ml（吸取時可旋轉針頭），放到新的15 ml離心管。

（十）用dropper取兩倍體積（約4 ml）的 Saturated l-butanol（含水），invert混合均勻後室溫離心2000 rpm、3分鐘，用dropper吸掉上清液；再用dropper取兩倍體積（約4 ml）的 Pure l-butanol（不含水）， invert混合均勻後室溫離心2000 rpm、3分鐘，用dropper吸掉上清液，這步驟可以去掉大部分的EtBr，準備乾淨的dialysis bag，將質體DNA用p1000移進袋子裡，放到4公升的TE中進行透析，此過程在4度C冰箱中進行，將裝好TE的桶子放在電磁攪拌器上，下方stir bar維持旋轉，6～8小時更換一次乾淨的TE，如此重複3～4次。

這裡要介紹的不是教你如何使用kit，因為鸚鵡學禪的方法在坊間所有販售的kit裡已經有清楚的說明書。如何不用column也可以抽出質體DNA？基因工程實驗常需要挑很多的「克隆（clone）」，挑選的方式不外PCR或colony hybridization這兩種，當實驗者挑到很多可能的「克隆」時，就必須將這些「克隆」進行質體DNA的抽取，以便之後的檢定工作。這裡介紹一個簡便又經濟的抽取方法（特別感謝榮總腎臟科 林堯彬醫師提供）。使用步驟如下：

(1) 將單一菌落（single colony）轉植到1 ml的 LB（事先一實驗設計需要加入特定的抗生素如ampicillin、tetracycline），放在37度C、240 rpm培養16小時。（可以用一般1.5 ml的eppendorf，用小釘子將蓋子口打個小洞）。16小時候將整支試管拿去離心一分鐘（16,000 g）。倒掉上清液，再用震盪器將底部的pellet打散（這步驟很重要，一定要確定打散喔！）。
(2) 加入 100 ul 的溶液S1，invert數下，使之混合均勻。（配方見下附註）。
(3) 加入 200 ul, 的溶液S2，小心輕輕地 invert數下（因為此時細菌的細胞壁被NaOH打破，細菌的染色體DNA外露，為避免斷裂，千萬不可太用力。），靜置室溫5分鐘 。
(4) 加入 200 ul, 的溶液S3，小心輕輕地invert數下後靜置冰上5分鐘。此時細菌的蛋白質和高濃度的醋酸鉀形成白色沈澱。（因為細菌的染色體DNA很長且包附在蛋白質上，會被一起抓下來）。
(5) 4oC離心16,000g 、 5 分鐘，將白色沈澱與上方質體DNA分開。
(6) 準備新的離心管（eppendorf），每隻試管加入1 ml的 酒精（純度至少95%）。
(7) 將步驟(5)的上清液移到酒精中，靜置冰上約30分鐘。
(8) 4oC離心16,000g 、 5 分鐘，倒掉上清液，留下下方pellet。
(9) 用70% 酒精 500 ul清洗pellet。
(10) 4oC離心16,000g 、 5 分鐘，倒掉上清液，用p200儘可能吸乾所有酒精液體。
(11) 倒扣試管室溫下靜置30分鐘，使底部pellet儘量乾燥。之後加入20～50 ul 的TE buffer（pH=8.0）。

理論上，此法所得到的質體DNA，其純度已經可以進行DNA限制酵素（restriction enzyme）的切斷實驗。因為細菌的染色體和蛋白質分離只依賴離心作用，所以質體DNA的純度並不如一般市面上販售的column kit，此方法只建議使用在初步篩選所有可能的「克隆」。如果實驗者挑選到正確的「克隆」，就質體DNA的純度和保存觀點，還是建議將正確「克隆」用column抽取。


附註：
Solution 1（500 ml）：秤重Glucose 4.5(g)、加入450 ml純水 stir至完全溶解；在加入0.5M EDTA （pH=8.0）12.5 ml、 1M Tris-HCl （pH=8.0）10 ml，最後補水到500 ml（autoclave後再補滅菌水），使用前加入RNAse（final....100U/ml）4oC保存。
Solution 2（1000 ml）：配置0.4N NaOH 500 ml，2％ SDS 500 ml（使用無菌純水）。等體積混合兩溶液即可。
Solution 3（200 ml）：秤重potassium acetate 58.89(g)，加入無菌純水120 ml，再用醋酸glacial acetic acid調整pH值為5.0（約23 ml），最後補無菌純水到200 ml，即為0.5M potassium acetate buffer。