實驗室手扎

這裡要介紹的不是教你如何使用kit，因為鸚鵡學禪的方法在坊間所有販售的kit裡已經有清楚的說明書。如何不用column也可以抽出質體DNA？基因工程實驗常需要挑很多的「克隆（clone）」，挑選的方式不外PCR或colony hybridization這兩種，當實驗者挑到很多可能的「克隆」時，就必須將這些「克隆」進行質體DNA的抽取，以便之後的檢定工作。這裡介紹一個簡便又經濟的抽取方法（特別感謝榮總腎臟科 林堯彬醫師提供）。使用步驟如下：

(1) 將單一菌落（single colony）轉植到1 ml的 LB（事先一實驗設計需要加入特定的抗生素如ampicillin、tetracycline），放在37度C、240 rpm培養16小時。（可以用一般1.5 ml的eppendorf，用小釘子將蓋子口打個小洞）。16小時候將整支試管拿去離心一分鐘（16,000 g）。倒掉上清液，再用震盪器將底部的pellet打散（這步驟很重要，一定要確定打散喔！）。
(2) 加入 100 ul 的溶液S1，invert數下，使之混合均勻。（配方見下附註）。
(3) 加入 200 ul, 的溶液S2，小心輕輕地 invert數下（因為此時細菌的細胞壁被NaOH打破，細菌的染色體DNA外露，為避免斷裂，千萬不可太用力。），靜置室溫5分鐘 。
(4) 加入 200 ul, 的溶液S3，小心輕輕地invert數下後靜置冰上5分鐘。此時細菌的蛋白質和高濃度的醋酸鉀形成白色沈澱。（因為細菌的染色體DNA很長且包附在蛋白質上，會被一起抓下來）。
(5) 4oC離心16,000g 、 5 分鐘，將白色沈澱與上方質體DNA分開。
(6) 準備新的離心管（eppendorf），每隻試管加入1 ml的 酒精（純度至少95%）。
(7) 將步驟(5)的上清液移到酒精中，靜置冰上約30分鐘。
(8) 4oC離心16,000g 、 5 分鐘，倒掉上清液，留下下方pellet。
(9) 用70% 酒精 500 ul清洗pellet。
(10) 4oC離心16,000g 、 5 分鐘，倒掉上清液，用p200儘可能吸乾所有酒精液體。
(11) 倒扣試管室溫下靜置30分鐘，使底部pellet儘量乾燥。之後加入20～50 ul 的TE buffer（pH=8.0）。

理論上，此法所得到的質體DNA，其純度已經可以進行DNA限制酵素（restriction enzyme）的切斷實驗。因為細菌的染色體和蛋白質分離只依賴離心作用，所以質體DNA的純度並不如一般市面上販售的column kit，此方法只建議使用在初步篩選所有可能的「克隆」。如果實驗者挑選到正確的「克隆」，就質體DNA的純度和保存觀點，還是建議將正確「克隆」用column抽取。


附註：
Solution 1（500 ml）：秤重Glucose 4.5(g)、加入450 ml純水 stir至完全溶解；在加入0.5M EDTA （pH=8.0）12.5 ml、 1M Tris-HCl （pH=8.0）10 ml，最後補水到500 ml（autoclave後再補滅菌水），使用前加入RNAse（final....100U/ml）4oC保存。
Solution 2（1000 ml）：配置0.4N NaOH 500 ml，2％ SDS 500 ml（使用無菌純水）。等體積混合兩溶液即可。
Solution 3（200 ml）：秤重potassium acetate 58.89(g)，加入無菌純水120 ml，再用醋酸glacial acetic acid調整pH值為5.0（約23 ml），最後補無菌純水到200 ml，即為0.5M potassium acetate buffer。